改善单细胞测序结果的细胞计数技巧
发布日期：2021-10-11 22:41:52
作者：中亚欧官网（转载必究）
单细胞测序技术使研究人员能够研究单个细胞的基因组和转录组。它们可以揭示异质人群中的低频遗传改变（使用批量测序技术可能会遗漏这些改变），并提供对健康和疾病条件下基因表达的见解。分离单个细胞是任何单细胞测序工作流程的第一步，将决定下游实验的成功与否。本文解释了自动细胞计数如何改善单细胞测序的结果，并指出在为您的研究选择自动细胞计数仪时要寻找的一些关键特性。
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单细胞测序工作流程在技术上具有挑战性
典型的单细胞测序工作流程包括从样品材料中分离单个细胞，提取和扩增 DNA 或 RNA 以构建测序文库，然后应用新一代测序技术进行样品表征。单细胞分离——这一过程的第一步——可以通过各种技术实现。其中包括有限稀释、荧光激活细胞分选 (FACS)、磁性细胞分离和一系列微流体技术，每一种技术都有其自身的优势和局限性。确定单细胞分离的有效性对于避免误导结果和防止在下游浪费时间、资源和宝贵的样品材料至关重要。
细胞计数验证样品质量
执行细胞计数提供了确定是否应该进行单细胞测序实验的信息。这包括细胞数量，它通常必须高于某个阈值水平才能产生可靠的结果，以及活力，它可以突出样品制备技术的任何破坏性影响。细胞计数还有助于确认团块已被去除（单细胞 RNA 测序等技术的关键考虑因素，其中双峰和多重峰会使数据分析复杂化）或细胞裂解后细胞核已被正确分离。
手动细胞计数容易出错
血细胞计数法是一种广泛使用的手动细胞计数方法；然而，众所周知，它容易出错。盖玻片放置不正确、对细胞是活细胞还是死细胞的混淆以及计算阶段的错误都可能导致结果不准确。此外，由于血细胞计数仅计算少量样本，因此可能会忽略团块的存在。通过解决这些问题，自动细胞计数已成为细胞计数的首选方法，特别是对于精度和实验重现性至关重要的单细胞测序应用。
自动细胞计数器提供更丰富的信息
与手动计数相比，自动细胞计数的一个主要优点是它允许采用标准化方法来消除用户偏见并提供更快的结果时间。自动细胞计数还产生更多的统计相关数据，因为它可以处理比手动方法更大的计数量；可提供每个样品最多可计数 5 µL 的仪器，相当于标准血细胞计数器计数体积的 10 倍。此外，由于一些自动细胞计数器可测量细胞数量和活力以外的参数，研究人员可以更好地了解样本质量，从而获得更准确的单细胞测序结果。
细胞大小是一个关键参数，可以通过监测来增强广泛的单细胞测序应用。对于需要完整细胞的技术，使用细胞大小来识别团块或碎片可以确认单细胞分离方法按预期执行。对于使用分离细胞核的应用，可以将细胞大小测量与吖啶橙/碘化丙啶 (AO/PI) 染色相结合，以防止分离的细胞核被错误识别为死细胞，并使研究人员能够计算未裂解细胞占总数的百分比细胞数量。
要考虑的细胞计数器功能
选择通用自动细胞计数仪时要考虑的因素包括仪器尺寸、操作简便性和制造商提供的支持水平。然而，对于单细胞测序应用，某些仪器功能可以提供特别的好处。首先，由于细胞计数的准确性对单细胞测序的成功至关重要，因此有必要检查定量限 (LOQ) 和 CV，包括常见样本类型，如解离组织、全血和培养细胞系。
同样重要的是需要确定是否生成了小区大小信息。在细胞大小直方图可用的情况下，研究人员可以轻松确定样品中单个细胞的分布，监测团块或碎片的存在，并结合 AO/PI 染色评估单核分离的质量。对于某些工作流程，执行高通量细胞计数的能力至关重要；对于其他人来说，确保自动细胞计数器符合 GMP 标准很重要。制造商将能够就仪器选择提出建议，并且在许多情况下，可能会建议针对特定单细胞测序应用进行相关升级。
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